先看问题：STR在降解检材和混合斑面前的两道坎
潮湿、高温、紫外线、细菌，都会把检材里的DNA切成碎片。高度降解样本的片段主峰常常落在150 bp以下。有个现成的参照：孕妇血浆里的胎儿游离DNA，中位片段长度约143 bp。它就来自凋亡这条天然降解路径。
常规STR试剂盒的扩增子大多在100到400 bp。长片段位点首先掉链子。就算扩出来，stutter峰也躲不掉。它是聚合酶在重复序列上滑移的产物，峰高大约占主峰的5%到10%。次要贡献者的等位基因一旦落在主峰stutter位置上，就分不清是谁的。
混合斑的对照数据更残酷。公安部物证鉴定中心的124重微单倍型研究里，9947A和2800M按1:19混合。STR只有38%的位点能报全次要贡献者的等位基因，微单倍型能报全92%。按有效位点算，1:19时STR是4.76%，微单倍型是91.94%。这个差距几乎是单方面碾压。
微单倍型为什么扛得住降解
司法部SF/T 0135-2023给的定义：在300 bp区域内含2个及以上连锁SNP、能检出3种及以上单倍型的多态性标记。它不靠重复序列，所以没有stutter。突变率接近SNP，比STR低。多个SNP组合成单倍型，等位基因数目比单个SNP多得多。
关键是短。van der Gaag 2018年选的那组短高变微单倍型，跨度不到70 nt。de la Puente团队的118个位点平均跨度只有51 nt，扩增子做到125到175 bp，专门按FFPE这类降解样本设计。Turchi团队2025年公布的76个微单倍型体系，含299个SNP，扩增子全部压在140 bp以内。150 bp是条心理线：低于它，高度降解检材里残余的片段还够扩；超过它，掉链子的概率陡增。
还有一点常被忽略：微单倍型的单倍型是读出来的，不是推出来的。同一扩增子里的SNP被同一条测序读段覆盖，相位直接确定。de la Puente团队比对公共数据库时发现，统计软件推相位的错误率，明显高于直接测序判相。
Ion Torrent S5 XL：硬件配置与实测指标
S5 XL是半导体测序仪。测序反应释放氢离子，芯片靠pH变化判读碱基，整机没有激光和光学系统。S5 XL和S5共用同一测序核心，XL的差别是内置计算服务器，二级分析在本地跑完。法医圈现在常见的是它升级命名的Ion GeneStudio S5系列，核心不变。
| 芯片 | reads数 | 200 bp读长输出 |
|---|---|---|
| Ion 510 | 200到300万 | 0.3到0.5 Gb |
| Ion 520 | 400到600万 | 0.6到1 Gb |
| Ion 530 | 1500到2000万 | 3到4 Gb |
| Ion 540 | 6000到8000万 | 10到15 Gb |
S5 XL最高配Ion 540芯片，单日吞吐上限约15 Gb。微单倍型的常规跑法不用这么大：Ion AmpliSeq文库试剂盒，1 ng起始，约22个循环。Ion Chef自动建模板，上Ion 530芯片，200 bp读长，500个flow。de la Puente团队在Ion S5上的实测：位点平均覆盖3572倍，错掺率0.29%，芯片装载率72%到90%。
短板也摆明说。半导体测序对同聚物（连续相同碱基）判读误差偏大。微单倍型设计时通常直接规避同聚物区，AmpliSeq引物设计规则同样要求引物不带长同聚物。即便如此，de la Puente体系里仍有5个位点在两个平台都失败，13个位点要人工复核。这是残余风险，不是零风险。
验证数据：降解、混合斑与多中心复现
降解与灵敏度
- Turchi团队76重体系，扩增子小于140 bp。0.05 ng即出完整图谱，真实案件降解检材绝大多数获得完整或近完整分型。案件比对LR从7.84×10⁹到2.70×10³⁴。
- 四川大学50重体系用DNase I模拟降解，2.5到15分钟。单一样本100%检出，1:10降解混合斑检出率93%到100%。同一批样本的长片段STR分型失败，拿不到完整图谱。这组在Illumina NovaSeq 6000上跑，逻辑对任何MPS平台通用。
- 商品化MHSeqTyper47试剂盒：灵敏度62.5 pg。降解指数不高于3.00的检材可获得完整分型。
混合斑
de la Puente团队做过1:3、1:5、1:7的模拟混合。两名分析员背靠背解卷积，次要贡献者约四到六成位点完整。按他们估算，40%位点完整度对应的累计判别力约10⁻³⁰，相当于GlobalFiler 21个STR的识别力。司法鉴定科学研究院的163重体系解过2到5人混合斑。9:1双人混合中，次要贡献者的全部等位基因都能检出。
也得承认边界：1:1的平衡混合，谁都难。124重研究的作者自己就说，这个比例下STR和微单倍型都无效。
多中心复现
Thermo Fisher的MH-74 Plex商业面板（74个微单倍型、230个SNP）是现成的跨实验室证据。四川大学在Ion S5 XL上完成汉族、藏族、彝族数据，有效等位基因数最高7.09。葡萄牙国家法医学研究所在Ion GeneStudio S5上测了237人，随机匹配概率3.86×10⁻⁵⁵。哥本哈根大学把MH-74作为复杂亲缘案件的补充面板，结论是混合斑解析优于STR。同一面板在亚洲和欧洲两个大洲复现，可比性才算有了。
误差控制清单
- 阈值先定死再谈结论。MH-74官方插件默认：每位置覆盖不低于20条reads、等位基因不低于5条reads、杂合子等位频率在10%到90%之间。163重体系用30倍深度加0.15杂合平衡。
- 每批必带阳性对照（9947A或9948）和阴性对照。SF/T 0135-2023有硬性要求。
- 先测降解指数。MHSeqTyper47的经验线是3.00，超过要有心理预期。
- 文库混样浓度压低，约20 pM，压制多克隆reads。de la Puente团队靠这步把多克隆比例从38%往下压。
- 盯住错掺率和链偏倚。Ion S5上的经验基线是0.29%左右，超标的位点逐个排查。
- 问题位点人工复核，不行就剔除。别硬留。
- 抽验与Sanger或公共数据库对账，一致性到99%才算过。
- 只有部分分型时走概率基因分型，用似然比说话，不硬拼完整图谱。
- 先判断贡献者数目和混合比例，再谈重建图谱。读深比峰高干净，但1:1平衡混合照样无解。
国内落地
标准先行。SF/T 0135-2023《法医微单倍型遗传标记分型与应用技术规范》2023年12月1日实施，由司法鉴定科学研究院、复旦大学、南京医科大学、四川大学起草。把微单倍型分型写进国家层面的司法鉴定行业标准，中国算动作快的。标准定死了选点规则：混合斑分析用Ae大于3的位点，族源推断用In大于0.185的位点，个体识别和亲缘鉴定用Ae大于3且杂合度大于0.4的位点。检测宜用高通量测序，每批带阳阴对照。
几个梯队。上海司法鉴定科学研究院的163重体系里，48个Ae≥3的位点子集累积个体识别能力为1减8.26×10⁻⁴⁴，是国内容量最大的公开体系之一。成都四川大学华西在Ion S5 XL上完成MH-74三人群数据，是国内少有的公开S5 XL微单倍型工作。北京公安部物证鉴定中心做了124重体系和MHSeqTyper47试剂盒评估。中山大学做过失踪人员混合斑的亲缘分析。贵州医科大学用自研33重体系完成了穿青人数据。
说实话，S5 XL上跑降解和混合斑的国内公开数据，比MiSeq系少一截。标准有了，体系有了，缺的是多中心降解检材验证。没别的。